細胞生物學(xué)的研究體系日益擴大。要想領(lǐng)略這種擴展,途徑之一便是去參加本領(lǐng)域的重要會議,諸如美國細胞生物學(xué)學(xué)會(American Society for CellBiology)的年會。你可以悠閑地漫步于大廳的展板區(qū),甚至于都不必駐足于某一版面,就可以深刻感受到細胞生物學(xué)范疇之遼闊。對于那些在過去一二十年間經(jīng)常光顧這種展廳的人們來說,細胞生物學(xué)的這種動態(tài)態(tài)勢以及這種爆發(fā)性的發(fā)展是毫不奇怪的——在愈來愈多的研究體系中只能是愈來愈多。以往展板區(qū)域主要由細胞的畫面主宰,這些細胞都經(jīng)由電子顯微鏡學(xué)家的固定(很呆板地),并且只是以黑白兩色顯示出來。雖然電子顯微鏡目前對于我們了解細胞構(gòu)筑仍然有貢獻,但新近展板區(qū)已出現(xiàn)一排排活細胞的電腦增晰視頻影像(computer-enhanced video images),這些細胞均經(jīng)過不完全活性染色才顯示,諸如羅丹明紅(rhodamine red)、熒光素綠(fluorescein green)以及被稱作綠色熒光蛋白的特異綠色等。冰凍蝕刻的加入則以冷凍定幀法(freeze frame)來展現(xiàn)細胞。此外在視頻影像間還散在有另一些展板,它們詳細記錄了眾多細胞成分的分子特征。還有一些展板報道了用基因削減或基因敲除顯示的有關(guān)它們功能的新近發(fā)現(xiàn)。正如羅盤的星點有其應(yīng)有的位置一樣,酵母、果蠅和蠕蟲的遺傳學(xué)研究興旺于一方,而在細胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)之間架設(shè)橋梁的研究也在另一方不斷地涌現(xiàn)。
很顯然,今天稱自己為細胞生物學(xué)家的科學(xué)家乃是一個多學(xué)科群體,這種多學(xué)科性質(zhì)隱藏著巨大的學(xué)術(shù)價值。那些曾經(jīng)將研究學(xué)科分隔開來的邊界如今已逐漸消失,細胞生物學(xué)家也已贊同沒有哪一種單獨的途徑可以揭開細胞的奧秘。新技術(shù)和新技術(shù)學(xué)隨著試驗成真并肩而至,并且用作細胞生物學(xué)在本領(lǐng)域開拓的工具。正是細胞生物學(xué)的這一面目的變化以及其代表巨大挑戰(zhàn)的方法學(xué)共同促成了《精編細胞生物學(xué)實驗指南》的問世。本書要闡述的一個基本問題是,在細胞生物學(xué)領(lǐng)域里應(yīng)在何處劃出其邊界。我們的決定是拒絕劃出這種邊界,因為它們完全是人為的,并且,糟糕的是,會產(chǎn)生反效果。相反,我們企圖努力彌合該領(lǐng)域的多樣性。本指南要包括那些對細胞生物學(xué)家仍有價值的“經(jīng)典的”方法,也要提供旨在成為今后之經(jīng)典的程序。
我們沒有理由懷疑細胞生物學(xué)的研究領(lǐng)域隨時都會很快地停滯。事實上,一名細胞生物學(xué)家之所以激勵不已,部分地出于革新和新發(fā)現(xiàn)所帶來的不間斷的驚奇。為此,我們這一專業(yè)需要一些可靠的、便于使用的,而且還要反映出該領(lǐng)域擴展的實驗方法學(xué)的資料。為了符合這一要求,我們收集了覆蓋細胞生物學(xué)眾多方面的一系列實驗方案,雖然這一套方案還不完全,但可以認(rèn)為它是一個“初學(xué)者工具箱”,包括有許許多多我們這一專業(yè)中最常用和必需的工具。
譯者序
前言
第1章 細胞培養(yǎng)
單元1.1 哺乳動物細胞培養(yǎng)的基本方法
基本方案單層細胞的胰酶消化和傳代
備擇方案懸浮培養(yǎng)的細胞傳代
支持方案1 人單層貼壁細胞的凍存
支持方案2 懸浮細胞的凍存
支持方案3 人細胞系的解凍與復(fù)蘇
支持方案4 用血細胞計數(shù)板和臺盼藍染色法測定細胞數(shù)目及活性
支持方案5 細胞運輸?shù)臏?zhǔn)備
單元1.2 適于哺乳動物細胞的培養(yǎng)基
基本方案1 制備含血清的培養(yǎng)基
基本方案2 制備血清減量或無血清培養(yǎng)基
基本方案3 HAT選擇培養(yǎng)基的制備
基本方案4 轉(zhuǎn)化細胞在軟瓊脂中的生長
支持方案1 培養(yǎng)基中pH的調(diào)節(jié)
支持方案2 抗生素在培養(yǎng)基中的應(yīng)用
單元1.3 細胞培養(yǎng)的無菌技術(shù)
基本方案1 無菌技術(shù)
基本方案2 層流式超凈臺的使用
單元1.4 滅菌和過濾
基本方案1 液體的高壓滅菌
備擇方案干燥物品的高壓消毒
基本方案2 干熱滅菌和清除熱原法
基本方案3 消毒劑的應(yīng)用:70%乙醇
溶液的過濾除菌
基本方案4 真空過濾
基本方案5 小體積非水溶性液體的正壓過濾
單元1.5 確定和控制細胞培養(yǎng)的微生物污染
基本方案1 細菌和真菌污染的檢測
基本方案2 直接培養(yǎng)法檢測支原體污染
基本方案3 應(yīng)用抗生素控制微生物污染
單元1.6 酵母培養(yǎng)及培養(yǎng)基
培養(yǎng)基的制備
酵母培養(yǎng)的綜合考慮
第2章 細胞的制備與分離
單元2.1 成纖維細胞培養(yǎng)的建立
基本方案
單元2.2 人淋巴細胞的制備和培養(yǎng)
基本方案1 通過高分子質(zhì)量的蔗糖一泛影鈉(Ficoll-Hypaque)梯度離心制備淋巴細胞
基本方案2 從淋巴細胞群里制備單核/巨噬細胞和樹突狀細胞
基本方案3 通過包被在磁珠表面的單克隆抗體分選T細胞和B細胞
單元2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的制備
基本方案
單元2.4 轉(zhuǎn)染EB病毒產(chǎn)生永生的B細胞株
基本方案
單元2.5 激光捕獲顯微切割
基本方案從組織切片中分離一種純的細胞群
支持方案蘇木素和伊紅染色組織的激光顯微切割
第3章 亞細胞組分分離和細胞器分離
單元3.1 細胞組分分離概述
單元3.2 分離大鼠肝細胞質(zhì)膜片層與漿膜結(jié)構(gòu)域
基本方案1 分離質(zhì)膜片層
支持方案1 檢測堿性磷酸二酯酶I的活性
基本方案2 分離質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域
支持方案2 K+激活的對硝基苯酚磷酸酯酶活性測定實驗
支持方案3 5'-核苷酸酶活性測定實驗
支持方案4 間接免疫熒光法檢測與質(zhì)膜片層相連的蛋白質(zhì)
單元3.3 利用差速及密度梯度離心法從組織和細胞中分離Golgi膜
基本方案1 利用蔗糖密度篩從大鼠肝臟中快速分離Golgi膜
基本方案2 將大鼠肝臟提取的輕線粒體組分懸浮于非連續(xù)的蔗糖梯度液中來分離Golgi膜
基本方案3 將培養(yǎng)的細胞懸浮于非連續(xù)的蔗糖梯度液中來分離Golgi膜
基本方案4 用自發(fā)形成梯度的IODIXANOL梯度液從肝細胞微粒體組分中分離Golgi膜
支持方案 測定UDP-半乳糖半乳糖基轉(zhuǎn)移酶
單元3.4 利用差速離心及密度梯度離心從組織及細胞中分離溶酶體
基本方案1 使用自發(fā)形成梯度的PERCOLL梯度液從大鼠肝臟中分離溶酶體
基本方案2 利用自發(fā)形成梯度的PERCOLL梯度液從培養(yǎng)的人HL-60細胞中分離溶酶體
支持方案1 酸性磷酸酶的測定
……
第4章 細胞生物學(xué)研究的工具——抗體
第5章 顯微鏡術(shù)
第6章 細胞蛋白質(zhì)的特性
第7章 電泳與免疫印跡
第8章 蛋白標(biāo)記和免疫沉淀
第9章 蛋白質(zhì)的磷酸化作用
第10章 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運
第11章 細胞增值,細胞衰老和細胞死亡
第12章 體外重建
第13章 細胞黏附與細胞外基質(zhì)
第14章 細胞的能動性
第15章 細胞器運動
附錄
參考文獻
索引